以PD-L1为例，教你不错过WB实验中看似不对劲的条带转自CST博士互助平台 导 语有时，眼见不一定为“实”！咋一眼看上去的条带大小与预测的分子量不一致，第一反应就是——哪里出了问题？其实，看到的条带位置不正确不一定就真的不正确！面临WB 实验条带位置的问题，我们需要透过现象看本质，挖掘研究靶蛋白的具体特征来判断条带的正确位置。 如何获得正确条带2018 年诺贝尔生理学或医学奖颁给了在肿瘤免疫领域做出突出贡献的美国免疫学家詹姆斯·艾利森（James P Alison）和日本免疫学家本庶佑（Tasuku Honjo），以表彰两位科学家发现了抑制免疫调节的癌症疗法。这种全新的癌症免疫治疗的方法拯救了许多癌症患者，同时，CTLA-4、PD-1、PD-L1等T细胞表面表达的分子也备受科研工作者的关注。PD-L1 在黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和肾细胞癌等许多肿瘤类型的细胞中表达 【1-3】，因而对PD-L1的表达情况的研究成了很多课题解开肿瘤免疫奥秘的首要任务。但对初出茅庐的同学们来说，可能判断PD-L1等蛋白的正确WB 条带位置很不容易。 要获得正确的蛋白条带，一般要从以下几个方面着手。1）了解该蛋白的特点蛋白的特点，对条带的位置影响很大，也是判断条带位置是否正确的最重要依据。通过一些网站了解要研究蛋白的特点，如 Uniprot 等。以下这些特点会导致实际分子量与预测的分子量不一致。a.该蛋白是否容易发生修饰b.该蛋白是否容易产生聚合体c.该蛋白是否具有各种同工型或异构体d.该蛋白不同种属来源的分子量是否一致 2）了解该蛋白的实际观察到分子量a.参考抗体说明书b.参考高质量的文献 3）样本的裂解程度a.通过匀浆、超声等物理作用让样本充分裂解b.选择合适的蛋白裂解液，保证目的蛋白充分富集 4）抗体的特异性使用经过验证而高特异性的抗体 5）其他WB 实验的细节a.胶本身的状态及电泳的条件会导致分子量的迁移b.不合适的封闭液、洗膜液、抗体稀释液等导致条带偏移 有了以上的要点，当我们无法判断条带位置是否正确时，就可以一一对应起来排查了。 以PD-L1为例（如图1），在不同的样本中，我看到的条带大小位置不一样，但是在Uniprot预测的分子量是33kD，那么到底哪个/些条带的位置是对的呢？ 似乎只有Jurkat 细胞实验得出来与预测的分子量一致的条带，可是图中在大约55kD的位置也多了一条带，不好判断呢。另外三组结果，不是位置不在33kD （在 Human skeletal muscle tissue 中观察到的条带大约是40KD）, 就是有高背景的拖带现象（在 HLDM-2细胞中是40-60kD之间，在NCI-H1975细胞中是40-50kD之间），看起来更不可能正确。到底哪组是正确的呢？ 我们一一根据上述的要点来排查。 1）  参考Uniprot。理论上，Uniprot预测的分子量是33kd。但是实际上，由于PD-L1  非常容易发生糖基化修饰，在大部分样本中看到的实际分子量都是在40kD-60kD 之间的，因此，在Human skeletal muscle tissue、HLDM-2、NCI-H1975 看到的条带都是蛋白翻译后高度糖基化修饰的结果，Jurkat 细胞中55kd 的条带也是发生乙糖基化的另一条带，是PD-L1表达的另一种形式。 2）  参考抗体说明书。以 CST 产品 PD-L1 (Extracellular Domain Specific) (E1J2J™) Rabbit mAb #15165 为例，说明书中给出的分子量是40-50 kD（如图2）, 并且在不同的样本中验证确实是在40-50kD 之间，因此，判断抗体识别蛋白的分子量最好参考抗体的说明书，以说明书为准。另外，文献上的数据也可以参考，如图3，使用E1J2J克隆的抗体在PC9野生型的细胞中观察到的实际分子量是在40-60kD的，这是正确的蛋白表达，不能由于不是理论上的33kD 就一直纠结实验的结果。 以上两点在很大程度在可以帮忙判断蛋白条带的位置是否正确。 3）&  4）样本本身裂解不完全、抗体不特异也会导致出现与预测不一样的条带。这两点我们完全可以通过提高样本和抗体的质量来解决。 5）最后，主要是一些实验细节，比如制备的胶质量、跑胶的buffer的新鲜程度及电泳的条件和WB 实验的配套封闭液和抗体稀释液等等，都会造成条带的偏差。这里，再给大家举个例子，Bip 蛋白的分子量是78kD，GAPDH  的分子量是37kD,但是图4显示，这两个蛋白的分子量都与预期有些许偏差，但是A204 细胞是Bip 高表达的一个细胞系，而且整张膜上条带特异，背景干净，就是分子量有些偏移，这样情况的出现很大原因是与跑胶的状态有关，条带的位置即使出现了些许偏差，我们还是认为是特异正确的目的条带。 总 结 判断WB 实验条带位置正确与否一点都不难，只要下足功夫研究蛋白的基本特点、仔细阅读抗体的说明书，问题基本能解决一大半，再佐以合适的WB实验步骤，问题就引刃而解了。 本文参考文献：1.Dong,H. et al. (2002) Nat Med 8, 793-800.2.Thompson,R.H. et al. (2006) Cancer Res 66, 3381-5.3.Pardoll,D.M. (2012) Nat Rev Cancer 12, 252-64.4.BoGong. et al. (2019)J Exp Med 4 ,216:982-1000更多好文，详见CST博士互助平台